实践掠影

一、   基本信息

编写依据: 2016版本科人才培养方案

课程名称（中英文）：分子生物学实验（Experiments on Molecular Biology）

学时学分：32学时，2学分

课程类别：专业课程

课程性质：必修

适用专业：生物工程

开设学期：第四学期

先修课程：生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学

开课单位: 生命科学学院

二、   课程教学目标

通过分子生物学实验课程的学习，要求学生能够加深对分子生物学基础理论的认识，掌握实验具体操作并理解其原理和步骤，能够掌握分子生物学研究的基本技术。激发学生对分子生物学及生物技术等相关实验课程的兴趣和进行科学研究的兴趣；培养学生的创新思维能力；以此来塑造学生的知识、能力、方法体系。

三、   课程教学要求

 通过分子生物学试验课程的学习，培养学生的自信心和坚持不懈的工作态度和学习态度，通过科研项目的分工合作计划，培养学生的团队精神、实事求是的科学态度、勤奋敬业和坚定诚信的品格，以此来建立学生的观念体系、品格体系。

四、   实验（实训）教学内容及学时分配

（一） 教学学时分配

 

     （二）实验（实训）教学内容           

实验（实训）项目一：分子生物学实验技术与试剂准备         

【目的】

实验室仪器、设备、药品及试剂的认识及准备

【原理】

基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

（1）限制性内切酶酶切与连接

（2）转化与转染

（3）聚合酶链式反应

【方法】

分子克隆的基本流程：

PCR扩增目的基因                           提取载体质粒

 

限制性内切酶双酶切                        限制性内切酶双酶切

 

DNA连接酶连接目的片段和载体

                            

  制备感受态细胞            转化感受态细胞

           

转化的细胞铺抗性平板

 

                       从平板上挑取单菌株，37℃培养

 

菌液PCR或抽提质粒酶切、PCR鉴定单阳性克隆

 

阳性克隆菌株保留甘油菌，并送出该菌或其质粒测序

 

实验（实训）项目二：质粒DNA的提取         

【目的】

学习并掌握质粒的常规提取方法

【原理】

普遍采用的碱变性法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理是，利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱变性条件下（pH 12.6），染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。分离质粒DNA的方法一般包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

质粒DNA的提取

 

【方法】

（1）在超净工作台上，用接种环挑取单菌落接种到50ml LB液体培养基（含100μg/ml的氨苄青霉素）中，37℃振荡培养过夜（约16小时）。

（2）取1.5ml菌液于EP管中，12000rpm离心1分钟，弃去上清，收集菌体。

（3）菌体中加入100μl的溶液I中，用枪头吹吸使菌体充分悬浮。

（4）加入200μl的溶液Ⅱ，轻轻颠倒3-6次（不要震荡），直至菌悬液透亮，室温放置5分钟。

（5）加入150μl冰冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒2-3次混匀，冰浴10分钟后，4℃、12000rpm离心10分钟，将上清液移至新的EP管中。

（6）上清液中加入等体积苯酚／氯仿抽提（抽提可多次重复，要求2次），充分混匀后室温12000rpm离心3分钟，取上层水相至另一干净的EP管中。

（7）加入2倍体积无水乙醇，充分混匀后冰浴0.5小时沉淀质粒DNA。

（8）4℃、12000rpm离心10分钟，弃去上清液。

（9）用1ml 75％乙醇漂洗沉淀块，12000rpm离心1分钟，弃去上清(洗2次)。

（10）沉淀块室温晾干后(10-15分钟)溶解在20μl 1×TE中，-20度保存。

 

实验（实训）项目三：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳         

【目的】

学习并掌握质粒DNA琼脂糖电泳的原理和方法

【原理】

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液(pH8.0-8.3)中，基其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多实验的要求。因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。

琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液体。浇在模板上冷却至40～45℃时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。

DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

质粒DNA琼脂糖凝胶电泳

【方法】

  1．选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。

   2．选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。

   3．制备0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。

   4．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

   5．琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。

   6．将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。

   7．将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。

   8．用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。

   9．盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100～150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。

   10．电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1～3小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254nm波长的透射紫外灯下观察。

 

实验（实训）项目四：质粒DNA酶切分析         

【目的】

1、了解限制性内切核酸酶的特性；

2、掌握DNA限制性内切核酸酶酶解方法和酶解效果的检测方法。

【原理】

限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。多种细菌能合成限制性核酸酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分子的重要手段。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序列。而细菌细胞内的DNA则由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被攻击，可是外源DNA一旦进入细胞立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。

限制性核酸内切酶的类型及特性，按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：

1. 第一类（I型）限制性内切酶：

        能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。

2. 第二类（II型）限制性内切酶：

        能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：

        粘性末端：交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端

如EcoRI的识别顺序为：

5'…… G'AA|TT_C ……3'

3'…… C_TT|AA'G …… 5'

垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和'表示在双链上交错切割的位置，切割后生成

5'G………  5'.AATTC

3'CTTAA.和3'……...G二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。　　　　　

平头末端：II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：

5'…… GAT'|ATC …… 3'

3'…… CTA'|TAG …… 5' 　

切割后形成5'…… GAT   ATC …… 3'

           3'……CTA和 TAG……5'二个片段，这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

3. 第三类（ III型）限制性内切酶：

也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

质粒DNA酶切分析

【方法】

1. 质粒DNA的双酶切

反应体系：

质粒DNA   10μL

无菌水           4μL

10×Buffer      2μL

EcoRⅠ          2μL

HindⅢ          2μL

总体积         20μL

轻弹管壁混匀后，2000g离心机瞬时离心

反应条件：温度37℃，水浴锅酶切1小时30分钟。

2. 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果

制备1％琼脂糖凝胶（含10μL /100mL gold view），120V电泳25～30分钟。

3. 紫外线透射仪观察，检查酶切结果（电泳图拍照）

4. 制备1％琼脂糖凝胶（含10μL /100mL gold view），用回收梳子，换新电泳液，100V电泳25～30分钟。（紫外线透射仪观察，电泳图拍照）

5. 紫外线透射仪下切胶（自己的切胶图拍照）

   每人准备灭菌的1.5mlEP一支，预先标注名字，质粒DNA还是目的DNA。

 6.切下的胶装入灭菌的1.5mlEP，放入-20度保存。

 

实验（实训）项目五：DNA片断的回收         

【目的】

1、掌握回收DNA片段的基本原理；

2、掌握回收DNA片段的操作步骤。

【原理】

琼脂糖凝胶在温和的缓冲液（DE-A  溶液）中熔化，其中的保护剂能防止线性DNA在高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

DNA片断的回收

【方法】

（1）在紫外透射仪下迅速切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，用纸巾吸尽凝胶表面液体。装入1.5mL的离心管中，计算凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（100mg=100μL体积）

（2）加入3倍凝胶体积的Buffer DE-A，混匀均匀后于75℃水浴加热，间断混合（每2-3min），直至胶块完全溶解（约6-8min）。

（3）加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混匀均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1倍凝胶体积的异丙醇。

（4）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml离心管）中，12000×g离心1min， 弃掉废液。

（5）将制备管置回2ml离心管，加500 μL BufferW1，12000×g 离心30 sec, 弃掉废液。

（6）将制备管置回2ml离心管，加700 μL BufferW2，12000×g离心30 sec，弃掉废液。以同样的方法再用700μL BufferW2洗涤一次，12000×g离心1min。

（7）将制备管置回2ml离心管， 12000×g离心1min。

（8）将制备管置回1.5离心管中，在制备膜中央加25μlEluent 或去离子水，室温放置3分钟。 12000g离心1分钟洗脱DNA。-20℃保存备用。

 

实验（实训）项目六：大肠杆菌感受态细胞的制备        

【目的】

掌握CaCl2法转化感受态细胞的制备

【原理】

感受态是指受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

CaCl2转化法（热激转化法）的原理是当细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，从而实现外源基因的转化。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

大肠杆菌感受态细胞的制备

【方法】

CaCl2法快速制备E.coli的感受态细胞

（1）取一环E.coli菌体，接种于10ml LB，37℃摇床培养过夜。

（2）取1ml过夜培养液于盛有100ml LB的三角瓶中，37℃摇床培养至OD600约为0.4（大约2.5小时）停止培养，放冰上冷却10分钟到0℃。

（3）取1 ml冷却菌液转入预冷的1.5ml 离心管中，4℃ 4000rpm离心10分钟，弃去上清液。（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）

（4）用移液器吸去剩余的培养基，然后用预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液1 ml轻轻悬浮菌体，冰浴15min，4℃4000rpm离心10分钟，弃去上清液。

（5）重复（4）步一次。

（6）弃去上清液，加入100μl预冷的0.1 mol/L 甘油-CaCl2溶液轻轻悬浮菌体，冰浴15min，即制成感受态细胞悬液。

（7）新制成的感受态细胞悬液于4度下存放24小时可转化效率最高。

（8）感受态细胞可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏。

 

实验（实训）项目七：PCR扩增DNA中的引物设计         

【目的】

学习并掌握PCR扩增DNA中的引物设计原理和方法

【原理】

  PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

PCR扩增DNA中的引物设计

【方法】

1.打开Primer premier5.0软件，调入基因序列：点击"file"    "open"   "DNA sequence"；或者直接点击"file"  "new"   "DNA sequence"，弹出一对话框如下图，然后将序列基因复制在空白框。

2.序列文件显示如图，点击"Primer"

3.进一步点击"search" 按钮，出现"search criteria"窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。我们将Product Size设置300－350，其他参数使用默认值。然后点击"OK" ，随之出现的Search Progress窗口中显示Search  Completed时，再点击"OK"。

4.这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标。

5.按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选。下面进行序列筛选：点击其中一对引物，如第21#引物，在"Peimer Premier"主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由"None" 变成"Found" ，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有"Found"，只有"None" 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。

 

实验（实训）项目八：DNA片段的体外连接反应        

【目的】

学会根据克隆要求对已酶切的载体与目的DNA的分子浓度比例进行调节并连接

【原理】

在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

DNA片段的体外连接反应

【方法】

按T4 DNA连接酶供应厂家（Vazyme公司）的推荐方法：

（1）  在一灭菌PCR管中配制连接反应体系：

                             实验组         

     10×T4 DNA连接酶Buffer        1μl           

酶切回收的目的DNA              7μl

酶切回收的质粒DNA              1μl          

     T4DNA连接酶（400U/μl）         1μl          

终体积                          10μl        

注意：外源片段与载体的摩尔比应该3:1—10:1之间。

（2）盖好盖子，轻弹管壁混匀，用台式离心机瞬时离心，将液体全部甩到管底。

（3）室温放置3小时或4℃/16℃反应过夜。

（4）连接反应完成后，连接产物用于转化感受态细胞。

 

实验（实训）项目九：大肠杆菌感受态细胞的转化和阳性克隆的鉴定         

【目的】

掌握细菌转化的原理，外源质粒DNA转入感受态细胞以及转化子筛选的方法

【原理】

质粒转化的原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

阳性克隆的筛选原理：利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。

蓝白斑筛选：

野生型大肠杆菌(E.Coli)产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。

原理：一些载体(如PUC系列质粒)带有β-半乳糖苷酶(lacZ)N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点(MCS)，可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出:未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

大肠杆菌感受态细胞的转化和阳性克隆的鉴定

【方法】

1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-80℃冰箱取出100μL感受态细胞，置冰上融化。

（3）加入10μL连接产物（连接产物的体积不超过感受态细胞体积的1/10,含量不超过50ng），轻弹混匀，冰浴30分钟。

（4）42℃水浴热激90秒（不要晃动）,然后迅速置于冰上，静置2-3 min。

（5）向离心管中加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，150rpm，37℃震荡培养45分钟，使菌体复苏，抗性基因表达。

（6）蓝白斑筛选：用含Amp（终浓度为50ug/mL）的LB培养基倒选择平板，每块约需20ml LB，凝固后在平板上滴加40μL 20mg/ml 的X-gal，4μL 0.2g/ml的 IPTG，用无菌涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。

（7）在超净工作台中取100—200μL转化菌液，滴加到选择平板上，用无菌涂布棒涂布均匀。在涂好的培养皿上做上标记，先室温正置15分钟。待菌液被平板吸收后，37℃倒置恒温培养箱培养过夜或12—16h。

（8）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。(或终止培养后，将平板4℃静置3-4小时，可使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白色两种菌落。)

（9）在含有Amp培养板上能生长的白色菌斑为转化菌落或阳性重组质粒。

用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质DNA产生5×106-2×107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。

 

实验（实训）项目十：哺乳动物基因组DNA的制备         

【目的】

掌握基因组DNA的常规制备方法，要求学会根据不同实验需求选择不同实验方法

【原理】

哺乳动物组织的基因组DNA以染色体的形式存在于细胞核内，分离提取时，利用SDS裂解哺乳动物组织细胞的细胞膜和核膜，使细胞破裂并释放出内含物，提取DNA。蛋白酶K将蛋白质降解，利用苯酚或氯仿抽提除去蛋白，以RNaseA降解并除去RNA，利用无水乙醇使水相中的基因组DNA沉淀，用TE溶液回溶沉淀的DNA，获得动物基因组DNA溶液。

提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

哺乳动物基因组DNA的制备

【方法】

（1）取新鲜或冰冻的哺乳动物组织块（鱼肝）0.1g，用无菌镊子和剪刀除去肝被膜和血管等组织，将肝组织尽量剪碎。置于无菌的玻璃匀浆器或研钵中，加入1ml细胞裂解缓冲液，匀浆或研磨至无肉眼可见的组织碎块。

（2）将匀浆或研磨后的组织液装入1.5ml Ep管中，加入20uL蛋白酶K，混匀。匀浆物置于 65℃恒温水浴锅中保温30min，中途混匀数次。

（3）12000 r/min离心3min，将上清液转至一只新Ep管中。

（4）加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提液混匀，10000 r/min，离心3min。

（5）取上相（水相）至另一Ep管中，用等体积的氯仿/异戊醇混匀，再抽提一次，10000 r/min，离心3min。

（6）取上相至另一Ep管中，加入1/10体积的7.5 mol/L乙酸铵，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，－20℃放置30min， 12000 r/min，离心10min。

（7）弃上清，用无菌的200ul枪头吸去管壁内的残余液体。

（8）用1mL70%乙醇漂洗沉淀后，12000 r/min，离心1min。弃上清，再洗一次。

（9）弃上清，用无菌的200ul枪头吸去管壁内的残余液体，室温干燥。

（10）加50μl 1×TE 65℃促溶15min，轻弹混匀。－20℃保存备用。

 

实验（实训）项目十一：基因组DNA的电泳分析         

【目的】

学习并掌握质粒DNA琼脂糖电泳的原理和方法

【原理】

提取得到的动物、植物、微生物等基因组DNA一般用于Southern、RFLP、PCR等实验。由于所用材料产量及质量均不同，有时提取的基因组DNA中含有酚类和多糖，会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后，均需检测DNA的产量和质量。

 采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳对提取的基因组DNA进行含量测定和质量检测。

DNA电泳一般以0.5×TBE为熔胶缓冲液和电泳缓冲液，琼脂糖凝胶浓度一般为0.7-0.8%，若分离两个大小很接近的片段，则用1×TAE熔胶。表1为凝胶浓度与DNA片段大小的关系。

样品DNA浓度的测算是用已知浓度的λ/HindⅢ或10kb marker作为对照和不同稀释度的样品DNA同时电泳，根据已知marker的DNA带的亮度推算出样品DNA的大概浓度。

表1 凝胶浓度与DNA片段大小的关系

琼脂糖凝胶浓度（%）	线性DNA分子的有效分离范围（kb）
0.3	5-60
0.6	1-20
0.7	0.8-10
0.9	0.5-7
1.2	0.4-6
1.5	0.2-3

【主要仪器设备及耗材】

  分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

基因组DNA的电泳分析 

【方法】

1. 紫外分析

         将提取的基因组DNA溶液稀释20-30倍后，在 Eppendorf 核酸蛋白仪上测定，记录 DNA 的浓度和OD260/OD280比值，明确DNA的含量和质量。

2. 凝胶电泳分析

（1）  凝胶的制备 、样品制备、点样、电泳及结果观察等步骤见参见实验三。

（2）取2-5uL提取的基因组DNA进行样品制备后，在1% 琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA的分子大小。

（3）根据DNA含量，取2-10ug基因组DNA，用10单位（U）HindⅢ于37℃消化1h。

反应体系：

DNA                μL

无菌水            μL

10×Buffer      2μL

HindⅢ           2μL

总体积          20μL

（4）将上述酶切产物和提取的基因组DNA在10mg/ml的琼脂糖凝胶(含10μL /100mL gold view)上，恒压电泳（72V，电压小于5V/cm），检测能否完全酶解。

 

实验（实训）项目十二：PCR扩增DNA的基本反应         

【目的】

了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术

【原理】

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)的原理类似于 DNA的天然复制过程。待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

（1）变性：加热使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

（2）退火：使溶液温度降至45—55℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

（3）延伸：溶液反应温度升至72℃，DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5’®3’方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。

       上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后 DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、Taq聚合酶。

【主要仪器设备及耗材】

分析天平、冰箱、离心机、水浴锅、高压灭菌锅、通风橱、纯水系统、恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、枪、电泳仪、凝胶显像系统、超净工作台、PCR仪、1.5mL 离心管、PCR管等。

【内容】

PCR扩增DNA的基本反应

【方法】

在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

1.PCR反应体系为：

纯水                                                 19 μl

10×PCR缓冲液(Mg 2+ Plus)        2.5μl

2.5mM dNTP                                     1μl

20μM上游引物                            0.5μl

20μM下游引物                            0.5μl

DNA模板                                          1μl

Taq DNA 聚合酶(5U/μl)             0.5μl

总体积                                            25.0μl

注：可以先计算好总量一次加好，再分装（引物最后加）

4对引物信息

1   F 5’ CGTGACATCAAGGAGAAG 3’

R 5’ GAGTTGAAGGTGGTCTCAT 3’

β-actin蛋白 长度：116bp 退火温度：57℃ 循环30次

2     F 5’ AGCAGAGAAGGACGTCAG 3’

R 5’ TTCCTTCTCGGCATGCTG 3’

PPARα蛋白 长度：202bp 退火温度：57℃ 循环30次

3    F 5’ CAGAGCTTCTCCTTGATGTC 3’

R 5’ GATATGGAGAAGATCTGGCA 3’

β-actin蛋白 长度：410bp 退火温度：54℃ 循环33次

4      F 5’ GCCTCCGTGCTGAACATC 3’

R 5’ TCTCTTTCTCGGCTTGGG 3’

PPARγ蛋白 长度：265bp 退火温度：55℃ 循环30次

 

 

2. PCR反应条件是：

1,2号引物

预变性  95℃     3min  

变性     94℃     30s   

复性  52℃     30 s          30个循环

延伸  72℃     30 s

72℃     5min

4℃    保温

 

3,4号引物

预变性    95℃    3min

变性        94℃     30 s

复性    50℃     30 s        30个循环

延伸    72℃     30 s

72℃     5min

4℃    保温

五、   测评方式(注：按照测评办法相关规定撰写)

1.预习（10%）

2.课内测验（10%）

3.实验（实训）操作（40%）

4.实验（实训）报告（40%）

 

六、   实验（实训）指导书及参考资料

1.郜金荣，分子生物学实验指导，化学工业出版社, 2015

2.郜金荣，分子生物学，化学工业出版社, 2011

 

 

备注：

1.项目类型分为验证性实验、综合性实验、设计性实验、单项技能型实训、综合技能实训；2.对于以单个项目开展的独立设置的实训课程(如课程设计)，按照选择项目、信息收集、方案设计、项目实施、成果展示等过程设计项目单元及教学内容，项目实施可以分成多个单元。